Biomoleküle einfach aufreinigen mit IEC

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Proteine einfach reinigen mit Ionenaustausch-Chromatografie (IEC)

Liebe Leserin, lieber Leser,

die Ionenaustausch-Chromatografie (ion exchange chromatography; IEC) ist für die Reinigung von Proteinen eine der wichtigsten chromatografischen Trennmethoden im biochemischen Labor. Hier erfahren Sie etwas über Prinzip und Anwendung der Methode.

Lernen Sie auch unser kompaktes AZURA® Bio Lab System kennen, das nicht nur für die Ionenaustauschchromatografie geeignet ist, sondern für die Automatisierung der Mehrzahl aller FPLC-Methoden wie Affinitäts- (AC), Hydrophobe Interaktions- (HIC), Ionenaustausch- (IEC), Größenausschluss-Chromatografie (SEC) einsetzbar ist.

Viel Spaß beim Lesen!

Grundlage

Die IEC-Methode

Weil Proteine durch die zwitterionische Natur ihrer Bausteine und ihre individuelle Struktur eine spezifische Ladungsdichteverteilung aufweisen, können sie mit einer geladenen stationären Phase differenziert wechselwirken.

Die Ionenaustausch-Chromatografie separiert Moleküle basierend auf ihrer Gesamtladung. Die stationäre Phase, ein Ionenaustauscher, wird nach den Ladungseigenschaften der Ziel-Proteine ausgewählt. Für Moleküle mit einer positiven Gesamtladung wird ein Kationenaustauscher (siehe Abb. 1) eingesetzt. Die stationäre Phase selbst ist entgegengesetzt, also negativ geladen.

Abbildung 1:
Kationenaustauscher (stationäre Phase, grau) mit stilisierten Proteinmolekülen (türkis)

Ablauf:

In der anfänglichen Phase binden geladene Proteine bei niedriger Ionenstärke des Bindungspuffers an die entgegengesetzt geladene stationäre Phase. Nach einem Waschschritt wird das Zielprotein durch eine hohe Salzkonzentration von der Säule eluiert. Dabei konkurrieren die Ionen des Elutionspuffers mit den gebundenen Proteinen um die geladenen Bindungsstellen der Säulenmatrix. Schwach geladene Proteine, die schwach an die stationäre Phase binden, eluieren bereits bei geringen Salzkonzentrationen, während stärker geladene Proteine erst bei höheren Salzkonzentrationen die Säule verlassen.

Die Ionenaustausch-Chromatografie besitzt eine hohe Bindungskapazität und wird daher häufig zur Proteinreinigung im frühen „Capture“-Schritt mehrstufiger Aufreinigungsmethoden verwendet.

Für eine reproduzierbare IEC wird ein FPLC-System benötigt, das Puffer-Gradienten präzise erzeugen kann.

Applikation

Trennung von Modell-Proteinen mit IEC

Die drei Substanzen α-Chymotrypsinogen A, Cytochrom C und Lysozym werden mit Hilfe eines Salzgradienten von der Kationenaustauscher-Phase eluiert. Die blaue Spur zeigt das Elutionsprofil (Chromatogramm) gemessen anhand des UV-Signals bei einer Wellenlänge von 280 nm. Die rote Spur zeigt den Verlauf des Leitfähigkeitssignals. Gut zu erkennen ist hier die linear ansteigende Leitfähigkeit durch den programmierten Salzgradienten.

Bei dieser Applikation kam ein AZURA® Bio Lab Purification System mit Kationenaustauschersäule zum Einsatz.

Zur Applikation (En)

FPLC-Multitalent

Das AZURA® Bio Lab Purification System für FPLC-Methoden wie die IEC verfügt über eine hochpräzise binäre Gradientenpumpe für Flussraten bis 50 ml/min mit zwei selektierbaren Puffern pro Kanal.
Das System mit metallfreiem Fließpfad erfüllt anspruchsvolle FPLC-Anforderungen und eignet sich für Affinitäts- (AC), Hydrophobe Interaktions- (HIC), Ionenaustausch- (IEC), Größenausschluss-Chromatografie (SEC).

Kompatibel mit allen gängigen Säulen
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Oliver Gültzow
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